Metody badania – morfologia

Morfologię krętków bladych można badać w mikroskopie świetlnym przy użyciu zwykłego systemu optycznego lub kondensora ciemnego pola widzenia, w mikroskopach: fluorescencyjnym, fazowokontrastowym i elektronowym. Tylko technika ciemnego pola i mikroskop fazowokontraśtowy pozwalają na badanie krętków w stanie żywym. W zwykłym mikroskopie świetlnym i w mikroskopach fluorescencyjnym oraz elektronowym ogląda się krętki nieżywe. Sposób przygotowania preparatów do tych technik mikroskopowych powoduje, że uzyskiwane obrazy mogą różnić się, niekiedy dość zasadniczo, od obrazów krętków żywych. Mikroskop świetlny. Krętki nie zabarwione są prawie niewidoczne w zwykłym mikroskopie świetlnym. Preparaty barwione można przygotować dwoma sposobami: metodą pozytywową, w której krętki nasyca się barwnikiem lub impregnuje metalami, np. srebrem, lub też metodą negatywową, polegającą na zabarwieniu tylko podłoża; krętki pozostają wówczas nie zabarwione i są dobrze widoczne na ciemnym tle preparatu. Barwienie pozytywowe. Wbrew ogólnemu mniemaniu krętki blade łatwo nasycają się różnymi barwnikami. Tak np. Yamamoto stwierdził, że 402 spośród 1315 badanych przez niego barwników dobrze barwiły krętki blade. Zabarwione krętki trudno jest jednak dojrzeć w mikroskopie świetlnym, ponieważ mają one małą ilość protoplazmy, a środowisko, w którym są zawieszone, zawiera zwykle dużo strzępków tkankowych, które również pochłaniają barwnik i zmniejszają kontrast. Pierwsi badacze używali barwników anilinowych lub pochodnych smoły węglowej, np. błękitu metylenowego, eozyny, błękitu Wiktorii, fioletu krezylowego, barwnika Giemzy i innych podobnych mieszanin. Dla zwiększenia efektu barwienia musiały być w tych wypadkach użyte bejce, tj. substancje strącające białko, takie jak fenol, kwas taninowy, kwas octowy, kwas fosfowolframowy i inne. W ostatnich latach doniesiono o udanym barwieniu krętków także za pomocą innych barwników. Goldsworthy i Ward oraz Jordan i Burrows użyli fenolowego roztworu fioletu goryczki, Levine — fioletu krystalicznego i zasadowej fuksyny, Vago — merkurochromu. DeLamater zastosowali w badaniach cyklu rozwojowego krętków bladych barwienie zmodyfikowaną techniką Fontany. Preparaty umieszczano najpierw w roztworze Ruge’a, złożonym z lodowatego kwasu octowego i formaliny, następnie utrwalano je bejcą Fontany i barwiono fioletem goryczki. Gomes zastosował z powodzeniem do barwienia krętków niebieski barwnik będący składnikiem atramentu „Parker 51″. Inna metoda pozytywowego barwienia krętków polega na impregnowaniu ich srebrem. Nadaje się ona szczególnie do wykazywania krętków w preparatach tkankowych. Lennhoff podał metodę barwienia krętków in vivo. Królikowi wstrzykuje się w miejsce zmiany kiłowej preparat koloidalnej zawiesiny rtęci i bezpośrednio potem podaje się mu dożylnie roztwór tiosiarczanu sodu; w ciągu 1 min. można znaleźć w płynie tkankowym zabarwione na czarno krętki. Barwienie pozytywowe stwarza pewne możliwości różnicowania krętków. Tak np. Coutts stwierdzili, że T. macrodentium i T. miciodentium łatwiej i szybciej barwiły się rozcieńczoną fuksyną fenolową, niż T. pallidum. Jeśli tak zabarwione preparaty oglądano w ciemnym polu widzenia, krętki blade wykazywały srebrzyste świecenie, natomiast krętki zębowe świeciły różowawo. Yamamoto doniósł, że dwa użyte przez niego barwniki niebieskie (Acid Blue BBX-BA i Alkali Blue-SB) barwiły T. pallidum i T. peitenue, ale nie barwiły T. cuniculi. Barwienie negatywowe. Do negatywowego zabarwienia krętków używa się zwykle tuszu chińskiego, czerwieni Kongo, nigrozyny lub cyjanochiny. Krytyczna oceina wartości poszczególnych metod barwienia krętków została podana w pracy Campbella i Rosahna. Ciemne pole widzenia. Technika ciemnego pola widzenia jest od dawna szeroko stosowania w laboratoriach. Pozwala ona na oglądanie żywych, poruszających się krętków i umożliwia oznaczenie ich liczby w zawiesinie. Metoda ta może mieć również zastosowanie do badania preparatów zabarwionych. Mikroskop fluorescencyjny. Krętki blade można uwidocznić także w mikroskopie fluorescencyjnym dzięki ich oddziaływaniu z surowicą kiłową ludzką lub króliczą, znakowaną barwnikiem fluoryzującym, np. izothiocyjanianem fluoresceiny. Dla zwiększenia swoistości reakcji Deacon i wsp. zalecają absorpcję surowic, przed znakowaniem fluoresceiną, zawiesiną rozbitych ultradźwiękami krętków Reitera. Yobs i wsp. zastosowali technikę immunofluorescencyjiną do wykazywania krętków w preparatach tkankowych. Mikroskop fazowokontrastowy. Technika mikroskopii fazowokontrastowej pozwala nie tylko na oglądanie żywych krętków, ale także na badanie ich wewnętrznej struktury dzięki wykorzystaniu różnic w zdolności załamywania światła przez różne elementy komórkowe. Niektórzy uważają, że w pewnych wypadkach może ona oddać nawet większe usługi, niż mikroskop elektronowy, mimo że powiększenia nią uzyskiwane są wielokrotnie mniejsze niż w mikroskopie elektronowym. Poetschke i Kaiser (118) zastosowali mikroskop fazowokontrastowy do wykazywania krętków w zmianach kiłowych — do badania cyklu rozwojowego krętków bladych. Ci ostatni autorzy zastosowali tę technikę mikroskopowania także do interpretacji obrazów Otrzymywanych w mikroskopie elektronowym. Mikroskop elektronowy. Mikroskop elektronowy ma o wiele większą zdolność rozdzielczą, niż mikroskop świetlny, co pozwala na uzyskanie w nim bardzo dużych powiększeń. Technika przygotowywania preparatów do mikroskopii elektronowej prowadzi jednak do pewnych zmian w wyglądzie krętków, w szczególności zaś do wydłużenia i spłaszczenia ich skrętków. Uszkodzenie powierzchniowych warstw krętków w trakcie preparatyki było powodem fałszywej interpretacji uzyskanych obrazów, jeśli chodzi o występowanie rzęsek u tych drobnoustrojów. Badania nad morfologią krętków bladych były prowadzone przez licznych badaczy przy zastosowaniu różnych technik preparacyjnych (barwienie negatywowe, ultracienkie skrawki i in.). Dostarczyły one także pewnych danych na temat wewnętrznej struktury krętków.

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany. Pola, których wypełnienie jest wymagane, są oznaczone symbolem *